FAQ

D. Quanto dovrebbe essere lungo un amplicone? R. Fino a 600 bp se si cercano microinserzioni o microdelezioni. Per sostituzioni puntiformi una sensibilità >96% si ottiene per frammenti di lunghezza compresa tra 180 bp e 450 bp. D. Posso utilizzare una qualsiasi Taq DNA polimerasi per la mia PCR? R. Sì, ma non qualsiasi tampone. La colonna cromatografica è sensibile a reagenti, stabilizzanti ed altri additivi presenti in molti prodotti commerciali. Va bene la TaqGold (Applied Biosystems). La presenza di uno qualsiasi dei seguenti reagenti danneggia la colonna e ne fa decadere la garanzia: BSA, olio minerale, formamide, proteinasi K, PEG, detergenti (Triton X100, NP40, Tween 20, SDS), glicerolo > 5%, DMSO, betaina e altri additivi proprietari sconosciuti. D. La composizione in basi del frammento può influenzare la sensibilità dell’analisi? R. L’analisi è condotta considerando il profilo di melting del frammento. Un elevata percentuale di GC può richiedere temperature d’analisi elevate che tuttavia non necessariamente ne riducono la sensibilità. Può essere utile invece evitare che uno stesso frammento contenga zone ricche di GC e altre ricche di AT. Il profilo di melting molto disomogeneo riduce la sensibilità. D. Il frammento che devo analizzare contiene diversi polimorfismi. Cosa posso fare? R. La sequenza diretta. Se possibile, è necessario escludere dal frammento amplificato tutti i polimorfismi con frequenza maggiore di 0,1. Si può cercare di ridisegnare i primers per mascherare i polimorfismi esonici. D. C’è la possibilità di verificare il profilo di melting dei miei ampliconi? R. All’indirizzo http://insertion.stanford.edu/melt.html è possibile calcolare il melting e le condizioni d’analisi al DHPLC. Il programma non fornisce però la curva di melting. In fase di ottimizzazione di un progetto di mutation screening, il nostro staff è disponibile ad analizzare il profilo di melting dei singoli frammenti suggerendo le eventuali modifiche.